Micropropagación del algarrobo

El cultivo de tejidos de especies del género Prosopis podría ser una alternativa para la reforestación de zonas áridas; puesto que la técnica de micropropagación posibilita la propagación clonal masiva de individuos élite. Sin embargo, las especies de Prosopis han mostrado cierto grado de recalcitrancia al cultivo in vitro (Harris, 1992).

Las especies de Prosopis, además de tener lento crecimiento, muestran una amplia gama de caracteres debido a su naturaleza heterocigótica. Después de una cuidadosa selección de germoplasma, un programa de mejora para resistencia a plagas y enfermedades podría iniciarse mediante métodos de reproducción convencionales, o en combinación con técnicas de cultivo de tejidos vegetales, células y protoplastos, con la finalidad de desarrollar clones de árboles élite (Bhansali, 2010).

Los reportes de regeneración de plantas completas a partir de yemas incluyen a P. alba,

P. chilensis, P. cineraria, P. glandulosa, P. julifora y P. tamarugo. Muchos de los factores que afectan la producción de plantas completas in vitro son aquellos que influyen en  el enraizamiento de los esquejes convencionales. Las diferentes especies de Prosopis responden de manera diferente a las mismas condiciones de cultivo in vitro. Por ejemplo, usando yemas apicales, Walton et al. (1990) obtuvieron diferentes respuestas en material vegetal de P. glandulosa (100 %), P. alba (94 %), P. juliflora (74 %), P. chilensis (67 %), P. cineraria (9 %) y P. tamarugo (4 %). Otros investigadores obtuvieron diferentes respuestas para cada una de las especies mencionadas (Harris, 1992).

Al igual que con las estacas convencionales, la edad de la planta madre, de la cual se extraen los explantes, influye en el éxito de la regeneración. Investigadores como Arce y Balboa (1991) y Walton et al. (1990) han reportado que conforme aumenta la edad de la planta madre, fuente de explantes, disminuye el enraizamiento in vivo. Sin embargo, hay reportes de regeneración de especies de Prosopis a partir de plantas madre bastante adultas. Esto se ha puesto en evidencia en el INIA; puesto que se han logrado clonar plantas madre de P. pallida procedentes de individuos longevos registrados en el Santuario Bosque de Pomac, en Lambayeque, Perú.

Se ha demostrado, en experimentos de corta duración, la formación de brotes múltiples y todas las etapas de un protocolo completo de micropropagación para Prosopis. Sin embargo, no se han establecido programas porque las especies del género Prosopis han demostrado tener recalcitrancia al cultivo in vitro sostenido. Después de un período en cultivo, los explantes se tornan cloróticos, se defolian y las yemas se necrosan (Tabone et al., 1986; Yao et al., 1989; Harris, 1992).

Las especies forestales leñosas como P. pallida, se caracterizan por tener un tejido lignificado que proporciona rigidez a las paredes celulares; son de crecimiento lento y ciclo vegetativo corto, por lo que se recomienda usar las yemas laterales o apicales para la propagación in vitro (Ramos, 2012).

En el INIA se ha realizado la micropropagación de algarrobo a partir de yemas apicales provenientes de plántulas germinadas in vitro. A continuación, se presenta el protocolo desarrollado:

Acondicionamiento de la planta madre

La planta madre, élite o stock es aquella a partir de la cual se extraen los explantes, que en este caso son las yemas. Es recomendable disponer de plantas madre en condiciones de invernadero o casas malla con el fin de mantenerlas adecuadamente sanas y vigorosas. Cuando es difícil mantener plantas forestales en esas condiciones, una alternativa es extraer una estaca de la planta élite del campo y clonarla, de esta forma se logra tener su réplica en condiciones de invernadero o casa malla.

Las yemas apicales para el establecimiento in vitro pueden ser extraídas de plantas madre o provenir de plántulas de la germinación de semillas de la planta élite. La edad de la planta madre influye en el éxito de la regeneración, es más fácil lograr el desarrollo in vitro a partir de explantes provenientes de plantas jóvenes que de plantas adultas, debido a que se requiere inducir el proceso de juvenilización.

También es importante el buen estado fitosanitario de la planta madre, por lo que se recomienda realizar aplicaciones quincenales de un fungicida sistémico para disminuir las posibilidades de contaminación en el establecimiento in vitro. Asimismo, una adecuada nutrición permite disponer de una planta vigorosa.

La estación del año influye mucho en la respuesta al establecimiento in vitro; aunque no se dispone de reportes para P. pallida. Harris (1992) menciona que las especies de Prosopis son similares a otros árboles con respuesta de enraizamiento estacional que parecen estar correlacionados con los ciclos estacionales de dormancia o crecimiento activo.

La aplicación de reguladores del crecimiento vegetal podría de alguna forma inducir un mejor establecimiento o disponer de mayor cantidad de brotes para su establecimiento in vitro; estos son temas que aún no han sido estudiados en esta especie.

Establecimiento o iniciación

Esta etapa corresponde al inicio en condiciones in vitro, para lo cual los explantes son desinfectados en condiciones asépticas y sembrados en tubos conteniendo medios de cultivo adecuados para su desarrollo.

En el caso de P. pallida se requiere realizar un tratamiento pre-germinativo para asegurar un alto porcentaje de germinación, que consiste en remojar las semillas en agua caliente (80 °C) durante diez minutos antes de proceder a la desinfección superficial.

La desinfección superficial tiene los siguientes pasos:

1. Lavar las semillas con detergente común, enjuagar con agua potable hasta eliminar los restos de detergente
2. Enjuagar tres veces con agua destilada
3. Remojar en una solución del fungicida Benomyl (0.2 %) durante una hora
4. Sumergir las semillas en alcohol al 70 % durante un minuto, en condiciones de cámara de flujo laminar
5. Remojar en una solución de hipoclorito de sodio durante 15 minutos
6. Enjuagar 3 veces con agua destilada estéril.

Luego sembrar en medio de cultivo de Murashige & Skoog (1962) - MS, contenido en tubos de ensayo. Incubar a 26 °C, con un fotoperiodo de 16 h luz y 3 000 lux de intensidad luminosa. A las dos semanas de la siembra, las plántulas provenientes de la germinación están listas para su subcultivo a medio de multiplicación.

Multiplicación

Es importante utilizar las microestacas a los 8 o 10 días de la germinación, y no dejarlas más días en el medio de germinación porque se debilitan las plántulas, lo que resulta en menor desarrollo de brotes. Esto coincide con lo reportado por Buendia (2017), quien indicó que para el género Prosopis, es recomendable no dejar pasar mucho tiempo después de germinadas las semillas para obtener los explantes.

Es necesario extraer las yemas con sus respectivas hojas cotiledonales y sembrar en medio de plantas leñosas –WPM (Lloy & MCown, 1980), libre de reguladores de crecimiento, y contenido en tubos de ensayo cubiertos con tapones de algodón y gasa estéril. Luego se incuban a 26 °C, con un fotoperiodo de 16 h luz y 3 000 lux de intensidad luminosa.

Se ha observado sensibilidad de microestacas de P. pallida a la alta humedad relativa contenida en frascos o tubos con tapas plásticas o cubiertos con papel aluminio. Por  tal motivo, se recomienda optar por el uso de tapas de gasa y algodón, para asegurar  la menor humedad relativa y,  por consiguiente, una mayor aireación en el tubo que  las contiene. Este procedimiento es de gran importancia para el desarrollo de los explantes, puesto que permite el intercambio gaseoso, el cual es un factor crucial para la translocación de nutrientes a través del xilema. Puesto que la mayoría de sistemas de cultivo de tejidos vegetales emplean frascos herméticamente cerrados para prevenir la evaporación, en algunos casos, estos sellos crean algunas condiciones físicas y químicas que dificultan el desarrollo de la planta (Rivera, 2017). Probablemente la condición  que tiene P. pallida como planta de climas desérticos condiciona su desarrollo a alta humedad, la cual ocasiona necrosis de los ápices y muerte de la microestaca.

Los subcultivos a un medio fresco deben realizarse cada 4 semanas, puesto que mayor tiempo conduce a la muerte de las yemas y entrenudos. Esto ocasiona que la tasa de multiplicación obtenida sea de 2.4 brotes/4 semanas (Rivera, 2017). Minchala et al. (2014) reportaron 2.8 brotes/ 90 días, y Goyal & Arya (1984) han estimado de 3 a 5 plantas regeneradas por explante en 100 días; ambos son periodos bastante diferentes de comparar.

Es importante considerar que pocos investigadores proporcionan la tasa de propagación promedio, considerando las pérdidas debidas a necrosis, contaminación, deficiencias del procedimiento de transferencia in vitro a in vivo, etc. Esta información debería reportarse porque ayudaría en la optimización de protocolos de micropropagación.

Las respuestas a la micropropagación difieren entre especies de Prosopis, y en la mayoría de casos se reportan bajas tasas de propagación. Por ejemplo, en P. cineraria se ha evidenciado que los explantes de diferentes genotipos, y aquellos que provienen del mismo genotipo, difieren en su potencial regenerativo en el mismo medio. Asimismo, estos explantes muestran variación significativa en la expresión fenotípica, relacionadas a la regeneración tardía, el tamaño, la longitud y el vigor de los brotes regenerados y la expansión de la hoja (Nandwani citado por Ramawat 2010).

Los resultados obtenidos en diferentes evaluaciones difieren debido a que emplean genotipos diferentes, siendo difíciles de reproducir y comparar. Ante esta situación,   es necesario indicar detalladamente las características de la planta madre utilizada    en las investigaciones, puesto que algunas especies serían muy recalcitrantes a la regeneración. Se han realizado varios intentos para demostrar la aplicación de técnicas del cultivo de tejidos vegetales a las especies de Prosopis; habiendo estado centradas las investigaciones usando explantes provenientes de plantas jóvenes (Jordan, 1987; Nandwani citado por Ramawat 2010).

Enraizamiento

Las plántulas, antes de ser retiradas del laboratorio para continuar a la siguiente fase, deben tener un adecuado sistema radicular que les servirá de soporte para mantenerse en el sustrato.

En esta etapa se busca lograr la formación de raíces en las plántulas obtenidas de la etapa anterior. Generalmente se usa auxinas para la inducción radicular, aunque algunas especies no requieren adición de éstas y, solo en un medio de cultivo basal forman su sistema radicular.

En el caso de P. pallida, es necesario que pequeñas microestacas de 2 a 2.5 cm de longitud sean subcultivadas a medio WPM adicionado de 0.5 mg/L ácido indol butírico (AIB). Luego deben ser incubadas durante 5 semanas a 26 °C, con fotoperiodo de 16 h luz, 70 % de humedad relativa, y 3 000 lux de intensidad luminosa.

Aclimatación

Esta es una etapa crucial en la micropropagación de cualquier especie, puesto que si no se logra aclimatar entre 90 y 100 % de las plántulas regeneradas, esta técnica no sería rentable. En esta fase se busca lograr que las plántulas enraizadas logren aclimatarse a condiciones ex vitro, es decir baja humedad relativa y alta luminosidad, y esto se realiza en condiciones de invernadero.

Teniendo en cuenta que las plántulas obtenidas tienen una delgada capa de cera cuticular y epicuticular, estomas, y son mayormente heterotróficas, es que se requiere un lento proceso de aclimatación. Durante este periodo es crucial disminuir paulatinamente la humedad relativa del microambiente en el que se están aclimatando.

Las plántulas a aclimatar son retiradas de los tubos que las contienen y se lavan con agua de caño para retirar los restos de agar adheridos a las raíces y cuello de la plántula, y así evitar el desarrollo de hongos saprófitos. Luego se procede a sembrar las plántulas en sustrato Premix #8 humedecido, el cual tiene en su composición musgo y vermiculita,  y se colocan en un fitotrón con fotoperiodo de 16 horas luz y alta humedad relativa. Después de una semana de iniciado el proceso de aclimatación se va disminuyendo progresivamente la humedad relativa hasta lograr las condiciones ambientales naturales a los 30 días. Se observará el crecimiento de las plántulas, así como la formación de nuevas hojas de apariencia cerosa. Transcurrido ese periodo, las plántulas aclimatadas de P. pallida están listas para su traslado a vivero.